Construcción de librerías
La preparación de librerías de alta calidad con alto rendimiento es un primer paso crítico en los flujos de trabajo y tiene un impacto directo en la calidad de los resultados de secuenciación. Es importante considerar el objetivo primario de un experimento de secuenciación antes de tomar una decisión sobre el mejor protocolo de preparación de librerías.
En que consiste la construcción de una librería?
En general, los pasos básicos en la preparación de ARN o ADN para el análisis NGS son: (i) fragmentación, (ii) fijación de adaptadores e índices a los extremos de los fragmentos complementarios a plataformas Illumina®, y (iii) en algunos casos, selección de fragmentos específicos para refinar el tamaño de la biblioteca, eliminando adaptadores u otros artefactos de la preparación de la biblioteca.
Condiciones del servicio
- Proporcionar de 50 ng a 1 μg de la muestra en 20μl de agua libre de nucleasas o lowTE.
- Las muestras deben estar libres de cualquier tipo de contaminante. Realizar la purificación utilizando columnas (Qiagen o similares), AMPure Beads (Beckman Coulter) o precipitación con etanol. En este último caso eliminar completamente las trazas de etanol para que no interfiera en los pasos enzimáticos de preparación de las librerías
- Cuantificar las muestras de manera precisa. Es mejor utilizar un método fluorimétrico por ejemplo Quant-IT (Qubit, Invitrogen), que por espectrofotometría o el equipo Bioanalyzer 2100 de Agilent.
- Proporcionar una imagen del gel de agarosa de las muestras para confirmar la integridad de las mismas.
- Si la muestra es cDNA, indicar el método utilizado para su síntesis.
- Si la muestra es RNA eliminar trazas de gDNA. Se recomienda utilizar muestras de RNA total con un valor de RIN>7 para proceder a la eliminación de rRNA o el enriquecimiento en mRNA.
Para más información, Illumina cuenta con un asistente online de selección de kits de creación de librerías:
http://www.illumina.com/library-prep-array-kit-selector.html
